摘要：目的探讨岩*连Corydalissaxicola对新生儿高胆红素血症（neonatalhyperbilirubinemia，NH）大鼠磷脂酶C（phospholipaseC，PLC）/磷酸肌醇（inositoltriphosphate，IP3）通路及听觉系统损伤的影响。方法取7d龄SD大鼠50只，用随机数字表法分为对照组、模型组及岩*连低、中、高剂量（40、80、mg/kg）组，每组10只；除对照组ip生理盐水外，其余各组大鼠均按μg/g的剂量ip胆红素建立NH大鼠模型。造模后，对照组和模型组ig给予10mL/kg的生理盐水，岩*连各剂量组ig给予相应剂量的岩*连提取物，各组均给药1d，3次/d。末次给药2h后，观察大鼠一般行为状况，检测脑干听觉诱发电位（auditorybrainstemresponse，ABR）和血清及脑干组织胆红素含量；HE染色观察耳蜗核组织病理变化；免疫组化染色法观察耳蜗核组织钙素（calcium，CaM）活性；蛋白免疫印迹法（Westernblotting）检测脑干组织磷酸化PLC（p-PLC）、IP3蛋白表达水平。结果与对照组相比，模型组大鼠出现烦躁等神经异常行为，耳蜗核组织可见神经细胞肿胀等病理损伤，ABR阈值、耳蜗核组织CaM阳性表达率、血清及脑干组织胆红素含量升高（P＜0.05），I、II、III波潜伏期明显延长（P＜0.05），脑干组织p-PLC、IP3蛋白表达降低（P＜0.05）；与模型组相比，岩*连低、中、高剂量大鼠上述神经异常行为及耳蜗核组织病理损伤得到缓解，ABR阈值、耳蜗核组织CaM阳性表达率、血清及脑干组织胆红素含量降低（P＜0.05），I、II、III波潜伏期明显缩短（P＜0.05），脑干组织p-PLC、IP3蛋白表达升高（P＜0.05），且岩*连发挥的作用呈剂量相关性。结论岩*连可激活NH大鼠耳蜗核组织PLC/IP3通路蛋白表达，减轻胆红素对耳蜗核听力神经系统的*害，改善NH大鼠听觉。
新生儿高胆红素血症（neonatalhyperbilirubinemia，NH）又称新生儿*疸，是指由于胆红素代谢异常使血中胆红素水平升高，导致皮肤、黏膜及巩膜*染的病症[1-2]。NH是新生儿常见病症，可导致新生儿急慢性脑病、脏器损害、神经*性及听力下降，甚至死亡等，严重危害新生儿生命健康[3-4]。听觉中枢更易受胆红素*性损害，据流行病学分析，超过70%的NH患者可出现脑干听觉核团、前庭核、下丘核等特定中枢核团的功能损害症状[5-6]。然而虽然学术界认同NH容易导致听觉损伤，但其听觉损害及中枢神经*性机制还不甚明确，这使得临床仍缺乏特异性、有效性的防治药物。近来研究发现，磷脂酶C（phospholipaseC，PLC）/三磷酸肌醇（inositoltriphosphate，IP3）通路可介导脑组织神经元凋亡发挥脑神经保护作用[7]，且能触发内质网钙库释放，促进新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞释放三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP），调节声转导、听敏度等生理活动[8]。故研究PLC/IP3通路在NH病理过程中的调控机制，对阐明听觉损害及中枢神经*性机制具有潜在临床价值。传统中药岩*连CorydalissaxicolaBunting富含生物碱，临床上常用于治疗急慢性肝炎、病*性肝炎、高胆红素血症、肝癌及其他肿瘤的辅助治疗[9]。近年来研究发现，岩*连可减轻NH的程度和持续时间及NH用药过程中的不良反应，对NH有较好的治疗效果[10]。但岩*连治疗NH的具体机制及对听觉损害的影响还未见报道，本研究建立NH大鼠模型，给予岩*连治疗，探究岩*连对NH大鼠PLC/IP3通路及听觉损伤的影响，以期阐明岩*连治疗NH的作用机制，为其临床合理用药提供实验依据。1材料与方法
1.1材料
1.1.1动物7d龄清洁级SD大鼠50只，体质量15～20g，雌雄不限，动物均无耳*性药物使用及强噪声暴露史，由广东省医学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK（粤）-。所有大鼠于本院动物房中饲养，自然光照，自由饮食、饮水，温度25℃，相对湿度50%，噪音低于80dB，保持动物房环境及鼠笼清洁、透气。本实医院伦理委员会批准（批准号ZMD-201090034），实验动物符合3R原则。
1.1.2主要试剂及仪器岩*连对照药材（货号A--1g）购自上海信帆生物科技有限公司，医院周静药师鉴定为岩*连C.saxicolaBunting；胆红素（货号QN-PFQ，橙色至暗红棕色结晶体）购自北京百奥莱博科技有限公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（货号G）购自北京索莱宝科技有限公司；大鼠总胆红素酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒（货号DIBR-）购自北京冬歌博业生物科技有限公司；钙素（calcium，CaM）、磷酸化PLC（p-PLC）、IP3抗体（货号分别为ab、ab、ab），均购自美国Abcam公司；BCA蛋白定量试剂盒和胰蛋白酶（货号分别为P、P），均购自美国Pierce公司。
RMRTS型手动轮转式切片机（德国Leica公司）；SMZ光学显微镜（日本尼康公司）；型蛋白电泳仪、Trans-BlotSD半干转膜仪（美国Bio-Rad公司）；GIS-凝胶成像仪（杭州米欧仪器有限公司）；CHARTREP/ASSR脑干诱发电位仪、TDH-39气导耳机（丹麦Interacoustics公司）。
1.2方法
1.2.1岩*连药液的制备参照文献方法[11]，岩*连药材用蒸馏水煎煮，取水提液浓缩干燥（每克干燥物中含生药量8g），取干燥物用生理盐水配制成0.5、1.0、2.0mg/mL（相当于生药量4.0、8.0、16.0mg/mL）的溶液（其中含岩*连总生物碱0.28～1.12mg/mL）。
1.2.2NH大鼠模型建立及分组与给药出生后7d的SD大鼠50只，采用随机数字表法分为对照组、模型组及岩*连低、中、高剂量（40、80、mg/kg）组，每组10只；除对照组外，其余各组新生大鼠均参照文献方法[12]按μg/g的剂量ip胆红素溶液（20mg晶体胆红素溶于1mL0.05mol/L氢氧化钠溶液中，加入蒸馏水9mL，用0.05mol/L的盐酸调节pH8.5，终质量浓度为2mg/mL，按1mL/kg剂量给药）建立NH模型，药物注射后于恒温、恒湿和避光环境中自然哺育24h，并观察大鼠行为活动，若大鼠出现烦躁、翻滚现象，表明造模成功。对照组大鼠ip等量生理盐水后置于同样条件下哺育24h。各组均于注射胆红素后30min开始给药，按10mL/kgig给予相应剂量的岩*连药液，对照组及模型组按10mL/kgig给予生理盐水，各组均给药1d，3次/d。
1.2.3大鼠一般行为观察各组大鼠末次给药2h后，观察大鼠有无烦躁、翻滚及俯伏等异常神经行为活动，耳廓反射及对外界刺激反应灵敏程度。
1.2.4大鼠听性脑干反应（auditorybrainstemresponse，ABR）检测各组大鼠置于隔声屏蔽室[本底噪声不大于30dB声压级（soundpressurelevel，SPL）]中，麻醉后，用TDH-39型气导耳机给声并紧贴大鼠外耳道口，设置脑干诱发电位仪听觉诱发参数为带通滤波～Hz，描时10ms，叠加次次，刺激声为交替短声。设置完参数，接通点击后开始进行测试，ABR反应阈的判断以II波为标准，刺激强度从90dBSPL开始，10dB一档递减至II波不可辨别，再以80dB的刺激强度测试大鼠双耳的各波潜伏期和波间期。数据经测试系统自身的微机自动读取、存储。
1.2.5大鼠血清及脑干组织标本采集及胆红素含量测定各组大鼠在测完ABR后，腹主动脉取血0.5mL，置于室温1h，凝固后，置4℃下过夜，析出血清，r/min离心10min后，取上清液加于测试管中，按胆红素ELISA试剂盒说明书方法检测血清胆红素含量。将大鼠麻醉，开胸，经左心室快速灌注生理盐水，冲净血液，随后缓慢灌注多聚甲醛磷酸缓冲液，然后断头处死，开颅取脑干组织，剪取1g后备用，剩余部分迅速置于上述灌注液中固定1周备用。从1g脑干组织中剪取0.5g，加0.5mL冰醋酸匀浆后，再加0.5mL丙酮混匀，于r/min离心10min后取上清液0.2mL，按胆红素ELISA试剂盒说明书方法检测血清胆红素含量，剩余脑干组织迅速置于?80℃冰箱保存。
1.2.6大鼠耳蜗核标本制作及HE、CaM免疫组化染色检测取“1.2.5”项下4%多聚甲醛溶液中固定1周的脑干组织，经脱水、透明、石蜡包埋后，经面神经根平面向后做连续冠状切片，片厚7μm，取从耳蜗核开始出现至消失的切片，共2套，一套根据HE试剂盒说明书进行HE染色，并在显微镜下观察组织变化，另一套用二甲苯脱蜡、3%过氧化氢消化过氧化物酶活性后，滴加1∶的CaM抗体，行CaM免疫组化染色，在共聚焦显微镜下观察切片中细胞染色情况，采用Image-proplus定量检测染成棕*色细胞数数目，并计算CaM阳性细胞表达率。耳蜗核定位参照《常用实验动物脑立体定位图谱》[13]和《大白鼠中枢神经系统解剖学基础》[14]进行。
CaM阳性细胞表达率＝染成棕*色细胞数/细胞总数
1.2.7Westernblotting法检测脑干组织p-PLC、IP3蛋白相对表达量取“1.2.5”项中?80℃保存的脑干组织，于4℃冰箱中解冻后，用组织匀浆器匀浆，离心分离后，取上清液，用蛋白提取试剂盒提取蛋白，蛋白定量BCA试剂盒检测蛋白总浓度后，取50μg蛋白上样，进行电泳和转膜反应，TBST溶液清洗后，加入5%脱脂牛奶室温下封闭1h，TBST溶液清洗3次后，加入一抗[p-PLC、IP3、β-actin（内参）]抗体，稀释倍数分别为1∶0、1∶0、1∶0），4℃摇床室温孵育过夜，TBST振洗后加入HRP羊抗兔二抗（稀释倍数1∶0），37℃摇床室温孵育1h，TBST清洗3次后，采用增强化学发光法显色，以凝胶成像仪观察条带并拍照，并以Image-J软件分析各组蛋白相对表达量。
1.3统计学分析
以SPSS22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以表示，多组间比较进行单因素方差分析，进一步两组间比较进行Snk-q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1各组大鼠一般行为
对照组大鼠行为活动正常，无烦躁、翻滚及俯伏等异常神经行为活动，耳廓反射及对外界刺激反应灵敏；与对照组相比，模型组大鼠出现烦躁、翻滚及俯伏等异常神经行为活动，且耳廓反射及对外界刺激反应迟钝；与模型组相比，岩*连低、中、高剂量组大鼠烦躁、翻滚及俯伏等异常神经行为活动明显减少，且耳廓反射及对外界刺激反应迟钝现象得到不同程度改善。2.2各组大鼠ABR各波潜伏期及阈值
与对照组相比，模型组大鼠ABR阈值升高（P＜0.05），I、II、III波潜伏期明显延长（P＜0.05）；与模型组相比，岩*连低、中、高剂量组大鼠ABR阈值降低（P＜0.05），I、II、III波潜伏期明显缩短（P＜0.05），且岩*连各剂量组上述指标呈剂量相关性，见表1。
2.3各组大鼠血清及脑干组织胆红素含量
与对照组相比，模型组大鼠血清及脑干组织胆红素含量升高（P＜0.05）；与模型组相比，岩*连低、中、高剂量组大鼠血清及脑干组织胆红素含量降低（P＜0.05），且岩*连各剂量组血清及脑干组织胆红素含量呈剂量相关性，见表2。2.4各组大鼠耳蜗核组织HE染色
对照组大鼠耳蜗核组织正常，染色均匀。与对照组相比，模型组大鼠耳蜗核组织可见胆红素沉积，各亚核神经细胞肿胀、数目减少，胞浆皱缩且有空泡形成，脂褐素沉积增多，尼氏体减少等病理现象严重。岩*连低、中、高剂量组上述病理损伤得到不同程度改善。见图1。2.5各组大鼠耳蜗核组织CaM免疫组化染色
对照组大鼠耳蜗核组织细胞染色正常，无棕*色颗粒沉积。与对照组相比，模型组大鼠耳蜗核组织细胞核染色较浅，棕*色或棕色颗粒增多，CaM阳性表达率增高（P＜0.05）；与模型组相比，岩*连各剂量组棕*色或棕色颗粒明显减少，且CaM阳性表达率呈剂量相关性降低（P＜0.05）。见图2和表3。2.6各组大鼠脑干组织p-PLC、IP3蛋白表达量
与对照组相比，模型组大鼠脑干组织p-PLC、IP3蛋白表达量降低（P＜0.05）；与模型组相比，岩*连低、中、高剂量大鼠脑干组织p-PLC、IP3蛋白表达量升高（P＜0.05），且岩*连各剂量组大鼠脑干组织p-PLC、IP3蛋白表达量呈剂量相关性，见图3和表4。3讨论
NH是新生儿常见病症，NH并发脑病可在急性期导致新生儿死亡，即使患儿幸存也常遗留神经系统疾病，尤其以神经系统损伤最为常见[13]。目前对胆红素的神经*性如何作用于脑干听觉核团导致听力损伤的机制尚不明确[14]。脑干听觉核团包括耳蜗核、上橄榄核复合体、外侧丘系核和下丘，是声音传导的重要通路之一[15]。ABR是应用于临床的听生理测试技术，可全面准确地记录声刺激后听觉系统所产生的一系列电位反应，可以判断听力损伤发生的部位及程度[16]。胆红素是水溶液中溶解度极低的极性分子，其阴离子可通过血脑屏障进入脑组织，并与神经细胞极性基团结合，并沉积在神经细胞膜，影响并抑制神经细胞能量代谢水平、神经末梢突触膜去极化反应、神经对冲动反应而使神经元化学传递作用及神经的电传导功能受损[17]。李克方[12]发现7d龄大鼠ipμg/g的胆红素24h，可使大鼠血清和脑组织胆红素含量增加，耳蜗核组织HE染色可见神经细胞损伤，免疫组化反应可见CaM阳性表达增加，推测胆红素沉积于耳蜗核的神经细胞突触膜，使细胞膜Ca2+内流超载，Ca2+与CaM结合后形成Ca2+-CaM复合物，发挥*性作用，导致耳蜗核信息的传入功能受到影响及ABR阈值升高、各波的潜伏期及听觉传导时间延长。本研究用μg/g胆红素ip7d龄大鼠24h后发现，与对照组相比，模型组大鼠出现烦躁、翻滚、耳廓反射迟钝或消失，对外界刺激反应迟钝或无逃避反应，耳蜗核组织各亚核神经细胞体积肿胀、神经细胞数目及尼氏体减少、胞质内空泡较多等病理现象，ABR反应阈明显升高且I、II、III波潜伏期明显延长，血清及脑干组织胆红素含量升高，耳蜗核组织中CaM阳性率增高[11]，提示造模成功。NH所致听力神经损伤在早期具有可逆性，一旦发生不可逆的听觉损伤，患儿只能用助听器及耳蜗植入等方式进行治疗，因此在NH早期及时进行治疗具有一定意义[18]。近来研究发现，岩*连对NH有较好的治疗效果，可减轻NH的程度和持续时间，刘馨烛等[19]发现岩*连可促进胆汁转运体表达，降低大鼠急性肝内胆汁瘀积，防止胆汁逆流入血，而出现血清胆红素升高。本研究发现，与模型组相比，岩*连低、中、高剂量组大鼠烦躁、翻滚、耳廓及对外界刺激反应迟钝等现象明显改善，耳蜗核组织病理损伤明显减轻，ABR反应阈降低且I、II、III波潜伏期缩短，血清及脑干组织胆红素含量降低，耳蜗核组织CaM阳性表达降低，且上述指标呈剂量相关性，表明岩*连可降低新生NH大鼠血清及脑组织胆红素沉积，减少耳蜗核组织CaM表达，缓解胆红素对耳蜗核听力神经系统的*害作用。然而其具体分子机制还不甚明确。Ca2+是神经系统正常活动和神经突触传导的重要信使，神经细胞内钙超载，可诱导线粒体的氧化应激反应，并激活大量蛋白水解酶，导致大量神经元和少突角质细胞大量死亡[20]，可能是胆红素沉积于耳蜗核的神经细胞突触膜，使细胞膜Ca2+内流超载，是导致神经*性的原因之一[11]。故促进胞内Ca2+释放，抑制细胞内Ca2+超载引起的神经坏死，可能是缓解胆红素对耳蜗核听力神经系统的*害作用的主要机制之一。而PLC/IP3通路介导的内网钙库释放，参与神经突触间传导和神经元可塑性调节，Melo等[21]发现多巴胺受体可与G蛋白偶联并激活PLC，活化后的PLC可促进IP3的释放，引起胞内内钙释放，发挥调节神经元生长、分化、生存的生理效应。刘斌等[22]发现在新生大鼠耳蜗血管纹缘细胞中，细胞外ATP在无钙离子的环境中，可以通过PLC-IP3途径触发内质网钙库释放，促进溶酶体的胞吐作用，从而将ATP以囊泡形式释放到胞膜外，调节声转导、听敏度、耳蜗内电位、耳蜗内环境稳定等神经信号传导。Luo等[7]发现褪黑素可激活PLC/IP3/Ca2+途径升高脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor，BDNF）水平，抵抗高胆红素引起的海马神经元凋亡和神经*性作用，而PLC/IP3通路阻滞剂可拮抗褪黑素对NH所致神经*性的抵抗作用。本研究发现，与对照组相比，模型组大鼠脑干组织中p-PLC、IP3蛋白表达降低，提示NH大鼠脑干组织PLC/IP3通路被抑制，可能抑制胞内Ca2+释放，导致胞内钙超载引起神经*性。而与模型组大鼠相比，岩*连低、中、高剂量组p-PLC、IP3蛋白表达呈剂量相关性升高，表明岩*连可能通过激活PLC/IP3通路，促进胞内钙释放，进而减轻胆红素沉积引起的胞内钙超载，改善脑干中神经损伤。综上所述，岩*连可激活NH大鼠耳蜗核组织PLC/IP3通路蛋白表达，缓解胆红素对耳蜗核听力神经系统的损伤，可能为阐明岩*连改善高胆红素沉积所致听力神经*性作用机制提供一定参考，但高胆红素沉积所致神经*性机制复杂，可能涉及其他通路，岩*连的具体生物学机制仍需深入研究。利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来源：雷瑞瑞，周栩平，王新华，李晶晶，周静．基于PLC/IP3通路探讨岩*连对新生儿高胆红素血症大鼠听觉系统损伤的影响[J].中草药,,52(12):-.
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