CTEC机制的成功实施的核心是FXIII在其活化肽被凝血酶切割后保持不活跃，并且它的酶活性可以被Ca2+诱导。因此，团队研究了HA-TG在存在和不存在Ca2+的情况下粘弹性行为的变化。当Ca2+扩散到样品中时，交联开始，立即表明FXIII的酶催化交联过程被激活(图2a)。另一方面，在无Ca~(2+)的情况下，材料的粘弹行为没有变化，证实了FXIII在其活化肽被裂解后仍然是无效的。
图2.CTEC在HA-TG生物油墨中的交联、适印性和组织成熟度。A)CTEC：用10μL的1mCaCl2外加HA-TG(1.5%HA-TG)，与负载FXIII和凝血酶但不含钙的HA-TG(1.5%HA-TG-无钙)和HA-TG与CNF(1.5%HA-TG-2%CNF)或SNAG(1.5%HA-TG-2%SNAG)纳米纤维混合的HA-TG进行交联，并通过外部添加10μL的1MCaCl2进行交联。
为了给需要软骨移植的患者提供另一种治疗方法，生物打印构建物不仅必须在体外短期内发展，而且必须在体内长期持续成熟。因此，我们在裸鼠皮下模型中测试了24周的生物打印圆柱形结构，并将它们的发育与体外培养的结构进行了比较。构建物首先在体外成熟3周(培养前期)，并对其组织成熟度和稳定性进行分析。随后，在体内另外6周、12周和24周后植入构建物并对其进行分析。生物打印构建体的细胞活性在打印后一天分别为73±1%和79±5%，反映了挤压过程相关的细胞损伤。[38]细胞增殖迅速弥补了活性的损失，7天后分别达到92.5±7.3%和95.3±4.2%，并在21天内保持稳定(图3a，b)。与铸型样本相似，生物印迹构建物在预培养阶段后出现不透明的白色外观，SHG进一步显示SNAG构建体中胶原的沉积。与CNF结构相反，在这些结构中可以看到I型胶原特有的长纤维图案和II型胶原特有的粗分布SHG信号图案(图3a)。图3.生物打印和体内新腺形成。A)在样本内拍摄25μm的代表性存活和倍频图像。标尺μM.b)对从样本表面获得的整个z堆叠进行活性分析，直到μm进入样本，n=3。c)左上角：在构建物皮下植入后立即拍摄的照片。右上角：显示愈合的伤口，只留下一小块伤疤的图片。下图：在活体24周(总共27周)后，在植入物的过程中拍摄的照片。红色箭头表示构件的位置。D)体外和活体样品在不同时间点的图片。比例尺：2mm。E)从体外和体内样品在各自时间点获得的应力应变曲线计算压缩模量。体外实验大鼠1只，大鼠2只，?大鼠3只，?大鼠4只，体外实验3只，体内实验12只。F)植入后和安乐死前的超声(上)和光声(下)图像。底排图像显示超声波和血氧饱和度重叠。标尺3mm，n=4.g)组织学和免疫组织学染色检测GAG(藏红花O)、I型胶原和II型胶原，并与人耳廓软骨进行比较。小耳畸形是一种先天性外耳畸形，发病率为每00名新生儿中有0.83到4.34个，具体取决于种族。到目前为止，*金标准治疗是自体肋骨软骨重建术，这是一种复杂的外科治疗方法。尽管对患者的心理社会健康有积极影响，治疗仍需要多达三次连续手术，足够的肋软骨(与年龄相关)，并且高度依赖外科医生塑造外耳的艺术和手术技能。尽管对患者的心理社会健康有积极影响，但治疗需要多达三次连续手术，足够的肋软骨(与年龄相关)，并且高度依赖外科医生的艺术和外科技能来塑造外耳。为了评估耳廓形状的结构的组织成熟度，团队开发了一个基于肋软骨重建的移植设计的三维模型，并对其进行了缩放，以适应未来的大鼠皮下植入。图4.生物印迹耳廓结构5周后的体外新耳廓形成。A)本研究使用的耳廓3D模型，标记了耳廓的所有标志。B)沿着耳朵的矢状面切开耳朵。力学特性被绘制在内侧部分，而外侧部分用于组织学。C)耳廓三维模型的壁厚分析。D)用于压缩试验和压痕映射的测量点。绿点：压缩测试，红点：压痕映射。在每个位置进行3次压痕测量。E)打印的耳朵和生物打印机的图片。F)根据d·样本1、样本2、?样本3、?样本4(n=4)中所示的不同测量点的压痕曲线计算赫兹模量。g)组织成熟后无细胞耳廓和耳廓的图像序列显示耳廓成熟后的柔韧性。G)耳廓软骨基质成分的组织学和免疫组织学分析。在这项工作中，CTEC生物印刷是为酶交联材料建立的，并用于开发两种新的生物墨水，为它们在耳廓组织工程中的应用提供了基础。结果表明，CTEC生物印刷可以促进酶交联材料的使用，从而提供了一种替代依赖于光交联或其他潜在的细胞*性交联机制的材料。CTEC机制进一步允许将先前在HA-TG水凝胶中报道的未完成的组织发育转化为生物打印。结构基本成熟，允许细胞增殖并沉积软骨样的细胞外基质。再加上耳廓结构的长期体内稳定性和成熟性，这些生物墨水使团队离用完全生物打印和组织工程化的解决方案治疗小耳畸形又近了一步。
从HA-TG作为可注射、快速凝胶的水凝胶用于关节镜下微创软骨损伤手术的软骨组织工程的最初目的出发，本研究证明了其有丝分裂和软骨诱导特性转化为生物打印。作为注射材料，HA-TG与其酶结合后可在数秒内形成稳定的凝胶。虽然这种交联过程为注射到病灶中留下了足够的时间，并确保了与缺陷的良好整合，但它与生物印刷是不兼容的。为了克服这一局限，我们将HA-TG与未经修饰的HA和纳米纤维结合起来，包括新引入的SNAG纳米纤维。这种材料成分的改变可能会对生物相容性产生负面影响。
综上所述，团队的研究为基于CTEC生物印刷的酶交联材料的生物印花提供了一种有价值的新工具。该机制将智能生物材料的使用扩展到生物打印，允许开发智能生物墨水平台。通过使用它，生物墨水可以精确地调整，以模拟目标组织的生物分子特征。它提供了多种可能性，如生物活性肽、信号分子、蛋白水解序列和粘附配体的结合，以及用于连接不同水凝胶系统的模块化结构。凭借这种延展性，CTEC生物印刷为创建各种特定于组织的生物油墨提供了一种通用工具。酶交联由于其固有的生物相容性，进一步克服了其他交联方式(如光聚合)的细胞*性。
最终，团队可以证明生物打印的软骨结构在体内的长期稳定性高达kPa，以及生物打印的耳廓的组织成熟。生物印刷是否会比传统的铸造方法更有优势还有待观察，但它的多功能性允许增加复杂性，如营养通道或精确放置的生物线索。这些结果，再加上成熟过程的微调，最终可能导致在小耳畸形患者身上利用患者自己的软骨残留物进行生物打印治疗。
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