生物3D打印技术在精确三维定位细胞和生物材料方面具有突出能力，因此功能组织的生物3D打印在应对组织器官缺损治疗方面具有广阔的应用前景，然而，目前该技术构建的功能组织仍不够成熟，成功率尚且有限。
近日，由PhilippFisch带领的瑞士联邦理工学院与MarinePolymerTechnologiesInc.的HNOLuzernerKantonsspital联合研究团队在AdvancedFunctionalMaterials期刊发表题为“BioprintingofCartilaginousAuricularConstructsUtilizinganEnzymaticallyCrosslinkableBioink”的文章，提出了一种基于FactorXIII活化级联的新型钙触发酶交联（calcium‐triggeredenzymaticcrosslinking,CTEC）的生物墨水机制，并将其用于软骨结构的生物制造。
研究显示，生物3D打印结构在体内保持稳定24周并且打印的耳廓结构转化为软骨移植物。该研究目前的一个主要局限是Ⅰ型胶原的沉积，这表明打印结构向纤维软骨而不是弹性软骨方向成熟。因此，未来有必要进一步促进打印结构向弹性软骨的方向分化成熟，因而开发相应的生物墨水对于为小耳畸形患者提供一种新的组织工程治疗方法具有重要意义。与此同时，CTEC生物3D打印还进一步开辟了酶交联生物聚合物及其模块化的应用，可支持多种组织。
生物3D打印为快速生成患者特定、结构复杂的组织和器官。一般而言，生物3D打印的组织结构需要一个成熟过程，期间可以人为引导细胞，通过调节生物物理和/或细胞指示信号，如粘附配体、蛋白水解域和形态发生信号等，使得细胞可以在这个成熟过程中重塑其3D环境，最终将组织结构转化为功能性组织。然而，目前生物墨水在模拟生物组织的空间、生物化学和时间复杂性方面仍然有限。理想情况下，生物墨水将构造一个模块化系统来同时处理组织成熟过程的几个方面，如此单个组件就可以互换来创建组织特异性仿生基质。
酶催化或酶交联就是这样一个模块化系统，具有的优点有：1、允许设计生物材料系统，以模拟天然组织生物分子特性；2、自然特性可以调节，以连接不同水凝胶系统的模块化结构；3、酶交联过程固有的生物相容性克服了化学交联中细胞*性的担忧。尽管有这些优点，酶交联存在着酶装载入生物墨水就开始聚合以至于材料不能有效挤出的问题。为了解决这个问题，可以在打印后将凝血酶（thrombin）、转肽酶（sortase）或京尼平（genipin）等扩散到构建体中，但存在着缓慢扩散速度、不适用于较厚组织的缺点。另一种方法是通过蒸发的过氧化氢（H2O2）扩散激活辣根过氧化物酶，但是需要包含自由基的相当复杂的系统。
基于现有缺点利用FXIII的激活级联开发了一种钙触发式酶交联（CTEC）生物3D打印工艺。FXIII在活化过程中，通过凝血酶对其活化肽的裂解，由酶原转化为酶的形式。随后，钙离子（Ca2+）导致A亚单位构象的改变，导致载体B亚单位的解离，从而暴露酶的活性中心。这个过程支持将酶FXIII和凝血酶混合到生物墨水中，并通过Ca2+的扩散触发3D打印后的交联过程（图1a）。作为模型水凝胶，使用了一种基于透明质酸的TG-PEG变体——HA-TG，与PEG相比，透明质酸是结缔组织、上皮组织和神经组织等多种组织细胞外基质的关键成分，是组织再生应用的理想生物聚合物。
本文报告了两种基于CTEC机制的生物墨水的发展，并描述了它们在软骨组织工程特别是耳廓中的应用（图1b）。证明了Ca2+从外部溶液中的扩散实际上可以激活FXIII并触发大结构的交联，并且在没有Ca2+的情况下，FXIII保持非活性状态。本文介绍了一种基于聚（N-乙酰氨基葡萄糖）（sNAG）的新型纳米纤维，由于其可生物降解性和可能与透明质酸的相互作用，它比纤维素纳米纤维（CNF）具有优势。人耳软骨细胞（hAUR）在已开发的生物墨水中大量增殖，导致ECM沉积和机械强度显著增加。生物3D打印样品在体外成熟3周，然后植入裸鼠皮下24周。最后，对耳廓结构进行生物3D打印，并分析其体外成熟为软骨移植物（图1c）。这些耳廓结构最终可能为小耳畸形患者提供一种新的治疗选择。
图1CTEC机制的工作原理示意图及其在生物3D打印中的应用
1.钙引发的HA-TG酶促交联
成功实施CTEC机制的关键是FXIII在凝血酶裂解其激活肽后仍保持无活性，并且其酶活性可由Ca2+诱导。因此需研究了在有和无Ca2+的情况下HA‐TG的粘弹性行为的变化。当Ca2+扩散到样品中时立即发生交联，而在不存在Ca2+的情况下，未观察到材料的粘弹性行为发生变化（图2a）。
将CTEC与传统的HA-TG交联方法进行比较，其缓冲液中存在Ca2+，传统反应交联发生更快产生凝胶更强，可能是因为Ca2+不必扩散到样品中故形成更均匀的交联网络。37℃交联与25℃相比交联更快但产生凝胶强度相近（图S1a，b）。后来用于调节3D打印适性的纳米纤维不会阻碍交联过程（图S1c）。因此，HA-TG可与FXIII和凝血酶结合而不发生交联，允许材料挤出以用于生物3D打印等，并且可在3D打印后通过Ca2+扩散到样品中实现交联。
图2HA-TG生物墨水中的CTEC交联、3D打印适性和组织成熟度
2.纳米纤维对可3D打印性的调制
为了便于3D打印，生物墨水需要一组特定的流变特性，这些特性由其剪切稀化、剪切恢复和屈服行为来描述。HA-TG和HA的零剪切行为和弱凝胶样特性不符合要求，因此不支持临床相关大小结构的生物制造。经转谷氨酰胺酶底物肽修饰后，HA的粘度显著下降，其对生物油墨流变性要求的影响可以忽略不计，主要功能仍然是3D打印后的交联机制。另一方面，未改性的HA具有更高粘度和相对低的存储模量（G′pa），不适用于大结构的构建，然而其高粘度可用于调整生物墨水的粘度。
聚（N-乙酰氨基葡萄糖）纳米纤维（sNAG）可以代替纤维素纳米纤维（CNF）作为人体可降解材料调节生物墨水流变特性。CNF溶液比相同浓度的sNAG溶液显示出更高的粘度。而sNAG溶液比CNF溶液在剪切后更好地恢复了初始储能模量。
将HA加入到生物墨水混合物中以减少所需纳米纤维的量，从而减少了粘性凝胶中的纳米纤维运动，形成能够保持3D形状的纳米纤维增强凝胶。将2%的sNAG与不同浓度的HA结合可增加复合材料的储能模量，并且，当添加至少1.5%的HA时，储能模量显著高于各混合物剪切前的储能模量（1.5%HA:.5±4.1%，2%HA：.7±2.6%），表明sNAG和HA之间存在协同效应。相反，将2%CNF与不同浓度的HA结合并没有显示出相同的协同效应，但由于其初始储能模量显著高于sNAG-HA溶液，CNF-HA溶液在剪切后达到相似的储能模量。
基于这些发现，我们开发了两种生物墨水：1、含有1.5%HA-TG、1.5%HA和2%sNAG（sNAG生物墨水）；2、含有1.5%HA-TG、1.0%HA和2%CNF（CNF生物墨水）。均可通过CTEC机制交联（图2b），并且都表现出具有屈服点的剪切稀化行为（图2c），并进一步显示了所需的剪切恢复行为。为了最终证明3D打印适性和交联性，我们将两种生物墨水3D打印成耳廓形状，交联，然后将其从3D打印基板上移除（图2f）。
3.已开发墨水中的组织成熟度
为了测试生物墨水的生物相容性和组织成熟度，将来自3个不同供体的人耳廓软骨细胞（hAUR）植入生物墨水中，并铸入圆柱形模具中，以消除3D打印过程影响。
为了使透明质酸酶或CD44结合蛋白等酶识别HA，需要至少一个未改性HA的六到八氯化钠序列。因此，取代度约为10–13%的HA-TG应被透明质酸酶和CD44识别。为了证明这一点，使用透明质酸酶降解HA-TG、sNAG-bioink和CNF-bioink构建体，均在5天内降解（图S3）。对于未修饰的糖类，透明质酸酶对HA-TG的降解也有类似的要求，表明HA-TG也可以被CD44识别。
从第1天培养开始，CNF和sNAG生物墨水细胞活力先上升后分别在94±3％和97±1％水平下维持稳定直至第21天（图2h，i）。此外，细胞开始增殖，在凝胶表面显示出扩散的形态，在21天后变为凝胶内部更深的圆形形态（图S4a）。随着时间的推移，观察到了二次谐波产生（SHG）信号的增加（图2i）。与第1天相比，两种生物墨水的样品均显示出较强的SHG，表明21天后胶原蛋白沉积。
样品外观与SHG信号存在平行变化，在第1天为半透明，在第21和63天为白色/不透明。成熟的样品相比未成熟能够承受更高的负载而不会破裂。压缩测试显示两种墨水样品在9周的过程中压缩模量增加。总体而言，与CNF样品相比，sNAG样品在21天和63天后显示出更高的压缩模量，表明sNAG生物墨水具有更好的成熟过程（21d：**p0.，63d：**p0.）。
组织学和免疫组织学分析进一步证实了两种生物墨水的成熟和组织发育。在第21天和第63天，观察到样本内有密集的细胞网络，细胞外基质充满细胞外空间。21天后观察到糖胺聚糖（GAG、番红O）、II型胶原和少量细胞周围弹性蛋白的软骨样基质组成，63天后强度增加（图2i和图S7）。尤其是II型胶原，在63天后出现的强度与人耳软骨相同（图S7a）。GAG沉积依赖于供体，样品中可见的最高GAG含量达到最高压缩模量（图S6和图S7b）。从第21天到第63天，sNAG和CNF构建物的GAGs染色强度显著增加。在第21天和第63天，与CNF样品相比，sNAG样品持续显示出更高的GAGs强度，但没有发现显著差异。弹性蛋白显示出持续的发展，特别是在sNAG样本中观察到细胞周围的弹性蛋白，尽管没有达到在人耳软骨中观察到的水平。除这些软骨成分外，还观察到I型胶原沉积增加，这在人耳软骨中并不存在（图S7c）。总而言之，这些结果证实了CTEC工艺的生物相容性，并证明了生物墨水支持组织向软骨移植物成熟的能力。开发的材料中的组织成熟的特征是细胞高活力、增殖、机械硬化和软骨样ECM沉积。
4.生物3D打印与体内新软骨形成
实用起见生物3D打印的构建体不仅要在体外短期发展，而且要在体内长期成熟。在皮下裸鼠模型中测试了24周的生物3D打印圆柱形结构，并将其发育情况与体外培养的结构进行了比较。构建物首先在体外成熟3周（预培养期），并分析其组织成熟度和稳定性。在此之后，在体内再植入6周、12周和24周后对构建体进行分析。
打印后1天，生物3D打印结构的细胞活力为73±1%和79±，CNF和sNAG生物墨水的细胞损伤率为5%，7天后为4.2%，并在该水平上稳定了21天（图3a，b）。与铸型样品类似，生物3D打印构建物在预培养期后出现白色不透明外观，SHG进一步表明胶原沉积在sNAG构建体中。与CNF结构相反，I型胶原的长纤维特征和II型胶原的粗分布SHG信号特征在这些结构中可见（图3a）。与CNF结构相比，sNAG结构显示出明显更明显的硬化增加。sNAG结构的压缩模量达到±21天后为23kPa，仅比铸造样品低1.2倍（±60kPa）。相比之下，CNF结构的压缩模量平均比铸型样品低2.5倍，达到（31±14kPa）（图3e）。由于皮肤张力在考虑植入结构时起着重要作用，而且结构越大，皮肤张力的影响就越显著，因此选择sNAG生物墨水进行长期的体内实验，因为它比CNF结构具有更高的压缩模量和更好的ECM沉积。
图3生物3D打印和体内新软骨的形成
皮下植入具有良好的耐受性，未发现不良反应，并且伤口显示出良好的愈合性（图3c）。移植后所有样品均完整无缺，并包埋在皮下结缔组织的薄层中（图3c，d）。样品的外观继续向不透明的白色组织发展。切开组织产生声音类似于切开天然软骨时听到的嘎吱声。宏观或光声均未观察到样品的血管化。如光声图像所示，高度血管化的皮肤层覆盖了样品（图3f和图S8c）。
5.生物3D打印耳廓结构中新软骨的形成
为了评估耳廓形状的构造物的组织成熟度，开发了基于肋软骨重建物移植设计的3D模型，并对其进行了缩放，以适合将来在大鼠中进行皮下植入（图4a，17.4mmx28.5mmx4.0mm）。
宏观上，耳廓结构由透明变为不透明，并伴有机械性僵硬。当耳廓结构在3D打印后因自重及一定外力弯曲时，具有足够的稳定性和弹性，以保持其形状（图4g）。对这些样品的分析显示压缩模量为55.9±19.2kPa。
压痕试验进一步证实了机械硬化。耳屏和耳垂区域的机械性能最高，表明GAG和II型胶原沉积增加，而I型胶原分布均匀。在由反螺旋体构成的上耳中部，扩散距离最大（图4c），测量的机械性能最低（反螺旋体）。此外，沿着反螺旋和肩胛骨向下至反螺旋，观察到与反螺旋体相似的II型胶原表达。在这些区域，GAG沉积高于中部，尤其是沿肩胛骨，这也显示出较高的机械性能。
我们的研究结果显示，新生软骨形成于生物3D打印的耳廓结构中，并伴有机械性硬化。此外，尽管由于扩散距离的限制，hAUR仍在继续改造其3D环境。提高营养的有效性可以促进耳廓结构中新软骨的发育，最终导致成熟的耳廓软骨的发育。最终，这种结构将为患者提供一种微创治疗选择和外观改善方式。
图45周后生物3D打印构建体的体外新软骨形成
这项研究建立了基于酶交联材料的CTEC生物3D打印，开发了两种新颖的生物墨水，为依赖光交联或其他具有潜在细胞*性的交联机理的生物墨水材料开发提供了替代方案；并应用于在耳组织工程中，实验表明这些生物墨水具有长期的体内稳定性。
PhilippFisch,NicolasBroguiere,SergioFinkielsztein,ThomasLinder,andMarcyZenobi-Wong.."BioprintingofCartilaginousAuricularConstructsUtilizinganEnzymaticallyCrosslinkableBioink."AdvancedFunctionalMaterials.