吡格列酮是预防噪声暴露引起的氧化性/炎性耳蜗损伤的有效治疗靶标
FabiolaPaciello1,2,3?，AnnaRitaFetoni1,2,3*?，RolandoRolesi1，MatthewB.Wright4，ClaudioGrassi1,5，DianaTroiani5*和GaetanoPaludetti1,2
·1IRCCS的FondazionePoliclinicoUniversitarioA.Gemelli大学，意大利罗马
·2意大利罗马天主教大学，耳鼻喉科学院
·3CNR细胞生物学和神经生物学研究所，意大利罗马
·4StrekinAG，瑞士巴塞尔
·5意大利罗马天主教大学，人类生理研究所
听力损失研究的最新进展为细胞氧化还原状态和炎症的失衡提供了有力的证据，这是影响Corti器官的常见主要损害机制，包括噪声引起的听力损失。发现作用于这两种机制的保护性分子具有挑战性。噻唑烷二酮是一类抗糖尿病药物，包括吡格列酮和罗格列酮，已在许多组织中表现出多种促营养作用，它们表现出抗炎，抗增殖，组织保护作用和氧化还原平衡调节剂，作为过氧化物酶体增殖物激活受体的激动剂（PPAR）。它们是配体调节的核激素受体家族的成员，它们也在多种耳蜗细胞类型（包括外毛细胞）中表达。在这个研究中，我们研究了吡格列酮在Wistar大鼠噪声诱发的听力损失模型中的保护能力以及这种保护作用的分子机制。具体而言，我们在生物相容性热凝胶中采用了吡格列酮制剂，可通过鼓膜注射提供快速，均匀和持续的内耳药物递送。噪声暴露后（dB，10kHz，1h），采用了不同的治疗方案：我们探讨了噪声暴露后立即（1h）或延迟时间点（24和48h）给予吡格列酮的疗效，以及评估听力恢复的时间过程和程度。我们发现吡格列酮能够在中高频保护听觉功能，并限制受噪声暴露损害的耳蜗基底/中转的细胞死亡。免疫荧光和蛋白质印迹分析提供的证据表明，吡格列酮可通过降低耳蜗中的NF-κB和IL-1β表达并抵制噪声损害引起的氧化损伤，从而介导抗炎和抗氧化作用。这些结果表明，鼓膜内吡格列酮可被认为是一种有效的治疗策略，可减轻噪声引起的听力损失和耳蜗损伤，减少炎症信号并恢复耳蜗氧化还原平衡。
介绍
听力损失研究的最新进展为影响Corti器官的常见主要损害机制提供了有力证据：细胞氧化还原状态和炎症的失衡。尽管尚未完全弄清具体损伤（例如，噪音，衰老，氨基糖苷类抗生素和抗癌药）激活的详细机制和途径，但已证明活性氧（ROS）的过量生产以及随后的脂质过氧化和细胞损伤和促炎性细胞因子表达是导致听力损失的主要主题（Priuska和Schacht，；Sergi等，）。）。对耳蜗生物系统的日益增长的了解确实提供了一系列令人兴奋的新型生物学靶标，其靶标调节可能使新型治疗选择成为可能。我们以前在动物模型中证明，通过靶向内源性防御途径，可以减轻听力损失和耳蜗损伤。我们已经解决了氧化还原失衡在噪声引起的听力损失（NIHL）和药物相关的耳*性中，我们提供了通过补充不同的抗氧化剂化合物（例如辅酶Q）激活Nrf-2/HO-1轴来保护耳蜗的证据。和多酚阿魏酸，迷迭香酸和姜*素（Fetoni等人，，A，年）。但是，一些问题（例如与多酚和其他草药产品的吸收和分布以及相互作用有关的问题）缺乏强有力的临床试验来证明这些新制剂的有效性和安全性，限制了它们在相关条件下作为辅助或预防性疗法的处方氧化应激（Mancuso，年）。因此，希望临床前研究不仅集中在细胞保护机制上，而且集中在上游细胞*性途径上，以鉴定能够解决氧化应激和炎症的途径和药物。值得注意的是，在过去的几十年中，越来越多的研究致力于PPAR，包括PPARα，PPARβ/δ和PPARγ。这些受体包括配体激活的转录因子的核受体超家族的一个亚家族，它们作为脂质传感器和多种代谢途径的调节剂起着至关重要的生理作用（Issemann和Green，；Green，；Kersten等，；Berger和Moller，；Wang等，）。此外，PPAR通过上调抗氧化剂相关基因的转录并抑制ROS的生成来参与氧化还原平衡的调控（Chen等，;Wang和Liu，;Abushouk等，）。迄今为止，大多数研究已经评估了PPARγ在肝脏，脂肪细胞，胰腺或骨骼肌等主要代谢器官中的作用（Tontonoz和Spiegelman，；Ahmadian等人，），从而将PPARγ用于治疗2型糖尿病。2糖尿病伴随着噻唑烷二酮（TZD）类药物的发展（Lehmann等，）。众所周知，TZD药物吡格列酮是FDA批准的PPARγ激动剂，可以减少2型糖尿病和冠状动脉疾病患者的炎症介质，并且对血管功能具有有利作用（Wang等人，年;Forst等人。，；Cabrera等，；Kauppinen等，）。此外，吡格列酮是唯一被批准具有显着穿越血脑屏障能力的PPARγ激动剂，并且已在阿尔茨海默氏病，帕金森氏病，癫痫和中风的模型中显示出神经保护作用（Kiaei等，；Hirsch和Hunot，；Hysch等）。Barnum和Tansey，；Carta等，;EspositoandCuzzocrea，；Sekulic-Jablanovicetal。，）。
有趣的是，最近已报道了耳蜗中PPAR的表达（Sekulic-Jablanovic等，）。发现PPARγ和PPARα在几种耳蜗细胞类型中高表达，包括内毛细胞和外毛细胞（HC）。此外，在Corti外植体器官中，吡格列酮和其他相关药物可通过阻止ROS升高，脂质过氧化作用，庆大霉素诱导的促凋亡胱天蛋白酶激活以及增强内在的细胞抗氧化防御能力，来有效地预防庆大霉素对毛发细胞的*性（Sekulic-Jablanovicetal。，）。此外，PPAR激动剂（如吡格列酮）也具有很好的多效性作用，这可能为听力损失提供其他保护机制（Rizos等人，年）。）。
基于这些发现，我们旨在目前的研究中评估吡格列酮在预防NIHL中的治疗潜力。为了确保快速且受控地将药物递送至内耳，我们在通过鼓室注射给药的生物相容性热凝胶中采用了吡格列酮制剂。噪声暴露后，采用立即和延迟治疗方案，并评估听力恢复的时间过程和程度。这些结果，以及对耳蜗氧化应激和炎症标志物的影响，表明吡格列酮是通过多种保护机制（包括早期降低耳蜗氧化应激和长期降低炎症信号）来治疗NIHL的引人注目的治疗靶标。
材料和方法
动物
这些研究使用了成年Wistar大鼠（UCSC实验室）–g，年龄2个月，具有完整的Preyer反射。对总共只动物进行实验，将其随机分为以下6个实验组：（1）对照动物（Ctrl组，n＝24）；（2）遭受声音创伤的动物（噪声组，n=24）；（3）对照组动物在左耳用吡格列酮1.2％悬浮液治疗，在右耳用相匹配的媒介物治疗（Ctrl-Pio和Ctrl-车辆组n=6）；（4）遭受听觉创伤的动物，在听觉创伤后1h（左耳噪声后1h组）给予吡格列酮1.2％悬浮液治疗（后噪声组1h），对右耳进行媒介物处理（噪声组1h后处理）（?=24）;（5）遭受声波损伤的动物，在声波损伤后24h，在左耳（Noise-Pio组，术后24小时）中使用吡格列酮1.2％悬浮液治疗，在右耳（噪声，车辆后24h）中，在右耳中使用媒介物处理过的动物（n=24）和（6）受到听觉创伤的动物，左耳用吡格列酮1.2％混悬液治疗（给药后48h，噪声-皮奥），右耳中溶媒治疗（治疗后，噪声车辆48h），48声音创伤后h（n=24）。每个笼子在可控温度（22–23°C）和恒定湿度（60–75％）下，在12小时的明暗循环中圈养两只动物，并随意喂食（Mucedola4RF21，意大利）和水，完整的实验期。
根据欧洲共同体理事会年11月24日的指令（86//EEC），已尽一切努力减少动物的痛苦并减少动物的数量。所有程序均按照罗马天主教大学天主教大学动物护理和使用委员会实验室的规定执行，并得到意大利卫生部（MinistryodellaSalute）的批准。
声学创伤
如前所述（Fetoni等，），由波形发生器（LAG-B，Leader，NY，美国）产生的10kHz连续纯音诱发声音创伤，并由音频放大器（A-R，Pioneer，CA，美国）放大。在麻醉下（氯胺酮35mg/kg和美托咪定-domitor0.25mg/kg），将所有动物放在固定摇篮中的隔音室中，用头和颈环将其头部轻轻地保持在固定位置。然后，将它们暴露在dBSPL声音下60分钟，该声音通过放置在动物头部前方10cm处的扬声器（TWX0，Audax，法国）在自由场中呈现给耳朵。使用校准的1/4英寸麦克风（型，ACOPacificInc.，贝尔蒙特，CA，美国）和校准的前置放大器（声学接口系统，ACOPacificInc.）来测量声级。
药物管理
通过单次鼓膜注射，动物接受1.2％吡格列酮悬浮液（StrekinAG，巴塞尔，瑞士）配制为热敏凝胶制剂或匹配的媒介物对照凝胶（载体）。媒介物配方（StrekinAG，巴塞尔，瑞士）由水，洗涤剂/表面活性剂，保持pH值的缓冲系统和作为热可逆成分的共聚物组成。按照公开的指南设计配方，以确保其在低于25°C的温度下保持液态，并在高于35°C的温度下转变为粘性凝胶（Malmsten和Lindman，年））。最终的药物产品是无菌的。为了评估吡格列酮从急性声损伤中恢复听力的能力，在暴露噪音后1、24或48小时对动物进行了治疗。所有外科手术均在无菌条件下，使用无菌技术和深度麻醉下进行（氯胺酮70毫克/千克，美托咪定-托米托0.5毫克/千克）。在准备注射时，使用手术显微镜对圆窗（RW）和RW壁the进行定位。使用22号1.5英寸短斜角针头进行注射，该针头在手术显微镜的帮助下连接到μl鲁尔锁Hamilton注射器上。在锤骨前进行鼓膜的小穿孔，以均衡中耳压力（Fetoni等，b）。在后下膜区域进行第二次穿孔，通过该孔以恒定速率（2μl/s）将30μl吡格列酮1.2％悬浮液或溶媒注入RW利基区。给药后，将动物保持至少10分钟，使给药的耳朵朝上，以确保测试物品的递送和与RW的接触。然后将动物放到对侧，然后使用相同的方法注射另一只耳朵。
听觉功能的电生理测量
通过在低（6kHz），中（12、16、20kHz）和高（24、32kHz）频率下测量听觉脑干反应（ABR）来评估所有动物的听力功能。为了确保听力正常，在噪声暴露之前对ABR进行了双侧评估，并在进行鼓膜药物注射后的1、3、7、14和21天进行了重新评估，以追踪恢复的过程。在此过程中，将动物轻度麻醉（氯胺酮35毫克/千克，美托咪定-吡美特0.25毫克/千克），并置于消声室中。如前所述（Fetoni等，），将三个电极皮下插入右乳突（活动），顶点（参考）和左乳突（接地）。带有实时数字信号处理的PC控制的TDT系统3（塔克戴维斯技术公司，美国佛罗里达州阿拉卡瓦市）数据采集系统被用于听觉刺激的产生和ABR记录。在开阔的野外，单音显示了由6至32kHz的纯音组成的音突发（上升/下降时间为1ms，总持续时间为10ms，重复率为20/s）。在每种频率-声级组合下，对响应进行滤波（0.3–3kHz），数字化并在个离散样本中求平均值。阈值定义为产生可重复的基于波形的发作的最低刺激水平（dB）。
毛细胞计数
罗丹明-*笔环肽是一种高亲和力的F-肌动蛋白探针，与红橙色荧光染料四甲基罗丹明（TRITC）共轭。该染色剂用于可视化毛细胞（HCs）的立体纤毛阵列和表皮板。经过功能分析（注射药物后第21天），动物（n＝6/组）用致死剂量的麻醉剂处死，然后迅速除去耳蜗，并制备Corti器官的表面制剂用于毛细胞计数。简而言之，将分离的耳蜗用10％福尔马林缓冲液固定4小时。除去骨囊和侧壁组织后，将Corti器官的上皮与骨矢状突分离，并在解剖显微镜下于0.1MPBS中解剖成半圈。然后将制剂与含有0.5％TritonX-和若丹明缀合的*笔环肽（1：稀释；MolecularProbes，Invitrogen，Carlsbad，CA，美国）的溶液在室温下在黑暗中孵育1小时。将样品在PBS中洗涤两次，然后固定在含有抗褪色培养基（ProLong，目录号P，Invitrogen）的载玻片上。使用共聚焦激光扫描系统（NikonTi-E，ConfocalHeadA1MP，东京，日本），使用激发波长为nm，发射波长为nm的滤光片对毛细胞进行定量。采集厚度为3-5μm的Z-stack系列，以×像素的图像记录，间隔为0.5μm。图像以40倍放大倍数拍摄（PlanFluo物镜，尼康）。沿基底膜的长度在?μm的切片中对毛细胞进行计数。评估HC损失的标准是在以前由毛细胞填充的空间中是否存在黑斑和/或支持细胞的典型指骨疤痕（采集厚度为3-5μm的Z-stack系列，以×像素的图像记录，间隔为0.5μm。图像以40倍放大倍数拍摄（PlanFluo物镜，尼康）。沿基底膜的长度在?μm的切片中对毛细胞进行计数。评估HC损失的标准是在以前由毛细胞填充的空间中是否存在黑斑和/或支持细胞的典型指骨疤痕（采集厚度为3-5μm的Z-stack系列，以×像素的图像记录，间隔为0.5μm。图像以40倍放大倍数拍摄（PlanFluo物镜，尼康）。沿基底膜的长度在?μm的切片中对毛细胞进行计数。评估HC损失的标准是在以前由毛细胞填充的空间中是否存在黑斑和/或支持细胞的典型指骨疤痕（Fetoni等人，年）。
超氧化物和8-异前列腺素检测
使用二氢乙锭（DHE）和8-异前列腺素免疫染色分别评估超氧阴离子和脂质过氧化产物。注射药物后第7天，记录ABR后处死一组动物（每组6只动物），并迅速去除耳蜗并固定在4°C和pH7.5的PBS中的4％多聚甲醛中。然后将耳蜗在EDTA中脱钙15d（10％EDTA，每天更换），在蔗糖（30％）中孵育48h，包埋在OCT（Killik，Bio-optica，Milan，Italy）中，冷冻切片至12μm（CryostatCM；SLEEmedicalGmbH，美因茨，德国）。对于所有的免疫荧光分析，通过在跨实验组随机选择的组织进行处理的过程中省略一抗来进行对照实验。耳蜗样品中没有染色，表明抗体既非自发荧光也非非特异性（数据未显示）。在手术过程中，始终将所有组的组织一起处理，以限制与抗体渗透，孵育时间，切片后年龄和组织状况有关的变异性。
超氧化物的检测（DHE分析）
DHE是一种亲脂性可渗透细胞的染料，在自由基超氧化物的存在下会迅速氧化为乙锭。生成的乙锭嵌入nDNA中，产生荧光信号，指示组织中的自由基水平（Fetoni等，）。耳蜗标本与1μDHE（目录号D，Invitrogen，Carlsbad，CA，UnitedStates）在PBS中孵育37分钟，然后用抗褪色培养基（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片。组织荧光通过超光速可调模式锁定钛：蓝宝石激光器（Chameleon，Coherent）执行的双光子激发（nm，fs，90MHz）成像。以20倍放大率拍摄图像（PlanApo物镜，尼康）。
8-异前列腺素免疫染色
8-异前列腺素是氧化应激的生物标志物，是一种在体内产生的前列腺素（（PG）-F2样化合物）通过自由基催化花生四烯酸的过氧化。为了检测8-异前列腺素，将载玻片在含有PBS中的1％无脂肪酸牛血清白蛋白（BSA），0.5％TritonX-和10％正常山羊血清的封闭溶液中于室温下孵育1h（Sigma-美国密苏里州圣路易斯的奥尔德里奇（Aldrich）。然后将标本与在PBS中以1：稀释的兔多克隆抗8-异前列腺素一抗（目录号IS20，OxfordBiomedicalResearch，英国牛津）在4℃孵育过夜。然后将玻片在PBS中洗涤两次，并在室温下于AlexaFluor标记的抗兔二抗（AlexaFluor，IgG；目录号A，Invitrogen）中以1：稀释稀释，在室温下孵育2小时，进行光保护。0.1MPBS。用PBS再次洗涤玻片，然后用DAPI（蓝色荧光，1：，目录号D，Invitrogen），以在室温下于黑暗中识别细胞核20分钟。然后用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片。使用配备氩/氩-k和氦/氖激光的共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，ConfocalHeadA1MP）捕获8-异前列腺素免疫标记标本（20x）的图像，以进行和激发。DAPI染色是由超快可调谐锁模钛：蓝宝石激光器执行的双光子激发（nm，fs，90MHz）成像的。通过绿色荧光鉴定8-异前列腺素阳性细胞。使用配备氩/氩-k和氦/氖激光的共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，ConfocalHeadA1MP）捕获8-异前列腺素免疫标记标本（20x）的图像，以进行和激发。DAPI染色是由超快可调谐锁模钛：蓝宝石激光器执行的双光子激发（nm，fs，90MHz）成像的。通过绿色荧光鉴定8-异前列腺素阳性细胞。使用配备氩/氩-k和氦/氖激光的共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，ConfocalHeadA1MP）捕获8-异前列腺素免疫标记标本（20x）的图像，以进行和激发。DAPI染色是由超快可调谐锁模钛：蓝宝石激光器执行的双光子激发（nm，fs，90MHz）成像的。通过绿色荧光鉴定8-异前列腺素阳性细胞。
为了进行荧光信号的半定量分析，在选定的N=12个切片上，使用ImageJ（版本1.51s）对与螺旋神经节神经元（SGNs），Corti器官和血管纹形成的器官相关的每个感兴趣区域的荧光强度进行定量每个实验组随机抽取6只动物。
NF-κB和IL-1β免疫检测
耳蜗中的炎性细胞响应于诱发耳蜗损伤的各种类型的损伤而被激活。NF-κB是涉及免疫和炎症以及细胞生长和死亡的基因的可诱导表达的关键调控因子。我们评估了吡格列酮对NF-κB和IL-1β（一种涉及耳蜗损伤的促炎性细胞因子）的影响（Komeda等，;Satoh等，;Wang等，））。如上一节所述制备的人工耳蜗组织（来自6只动物/组，第7天）在室温下于含有PBS中的1％BSA，0.5％TritonX-和10％正常山羊血清的封闭溶液中孵育1小时。温度。然后将载玻片与含有兔单克隆抗NF-κB一抗（1：，目录号＃，CellSignaling，丹佛，马萨诸塞州，美国）的溶液在4℃孵育过夜。-IL-1β一抗（1：，SantaCruzTech。，产品目录号sc-，SantaCruz，CA，美国）在PBS中以1：稀释。将载玻片在PBS中洗涤两次，然后在避光条件下于AlexaFluor标记的抗兔二抗（AlexaFluor，目录号A和AlexaFluor，IgG，目录号1）中于室温孵育2小时。A，Invitrogen）在0.1MPBS中以1：稀释。在PBS中再次洗涤后，将样品在室温下黑暗中用DAPI（蓝色荧光，1：）复染20分钟。通过在跨实验组随机选择的组织的处理过程中省略一抗来进行对照实验，表明该抗体既无自发荧光也无非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和在室温下黑暗中，将样品用DAPI（蓝色荧光，1：）复染20分钟。通过在跨实验组随机选择的组织的处理过程中省略一抗来进行对照实验，表明该抗体既无自发荧光也无非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和在室温下黑暗中，将样品用DAPI（蓝色荧光，1：）复染20分钟。通过在跨实验组随机选择的组织的处理过程中省略一抗来进行对照实验，表明该抗体既无自发荧光也无非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和）在黑暗中于室温下放置20分钟。通过在跨实验组随机选择的组织的处理过程中省略一抗来进行对照实验，表明该抗体既无自发荧光也无非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和）在黑暗中于室温下放置20分钟。通过在跨实验组随机选择的组织的处理过程中省略一抗来进行对照实验，表明该抗体既无自发荧光也无非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和通过在跨实验组随机选择的组织的处理过程中省略一抗来进行对照实验，表明该抗体既无自发荧光也无非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和通过在跨实验组随机选择的组织的处理过程中省略一抗来进行对照实验，表明该抗体既无自发荧光也无非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和表明抗体既非自发荧光也非非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和表明抗体既非自发荧光也非非特异性（数据未显示）。用抗褪色介质（ProLongGold，Invitrogen）盖玻片滑动，然后使用共聚焦激光扫描显微镜（NikonTi-E，共聚焦）捕获NF-κB（红色荧光）和IL-1β（绿色荧光）的图像。头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩–气和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和共焦头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩-k和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和共焦头A1MP）配备了用于和激发的氩/氩-k和氦/氖激光。以20倍放大率拍摄图像。分析每个感兴趣区域的荧光强度，对应于SGN，Corti器官和如上所示定量血管纹。
蛋白质印迹
进行免疫印迹是为了确认对NF-κB和IL-1β表达的免疫荧光结果。在药物处理后第7天最后一次ABR记录之后，处死动物（6只动物/组）。与先前描述的方法类似（Fetoni等，），解剖的耳蜗收集在冰上，储存在-80°C，然后用RIPA缓冲液（Sigma-Aldrich）匀浆。离心（12,rpm，15分钟，4°C）后，使用MicroBCA试剂盒（Pierce，Rockford，IL，美国）测定上清液中的蛋白质浓度。将每个含有60μg蛋白的上清液的等分试样与4X还原缓冲液混合，然后煮沸3分钟，然后用4-15％的Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶分离。ColorburstTM标记（Sigma-Aldrich）用作分子量标准。然后将分离的蛋白质在含有50mMTris/HCl，mM甘氨酸和20％甲醇的溶液中转移到硝酸纤维素膜上，并用PonceauS（ICNBiochemicals，都柏林，俄亥俄州，美国）染色。非特异性位点用TTBS中的5％干奶封闭，并将膜与抗NF-κB（1：0；细胞信号转导）和抗IL-1β（1：；SantaCruzTech。）抗体。洗涤膜并与辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG二抗（1：;Promega，Madison，WI，UnitedStates）孵育，然后使用增强的化学发光试剂（RPN目录，GEHealthcare，Cardif，UnitedStates）进行显影。王国）。
统计
结果表示为平均值±SEM。通过使用学生t检验分析数据，以确定组之间的显着差异。通过重复测量（组×耳蜗转弯）的双向方差分析评估OHC生存的形态学数据。事后比较是通过Tukey检验（Statistica，Statsoft，Tulsa，OK，美国）进行评估的。显着性水平设定为0.05。
结果
吡格列酮可减轻听力损失并促进OHC生存
为了研究吡格列酮对听觉功能的保护作用，我们评估了噪声暴露前和单次鼓室给药1.2％吡格列酮或匹配媒介物后1、3、7、14和21天动物的ABR听力。实验组之间的基线ABR阈值没有差异，与先前的数据一致（Fetoni等，）。为了更好地评估吡格列酮的有效性，我们在这项研究中纳入了雄性Wistar大鼠，考虑到雌性中的性激素和糖皮质激素可以对压力和炎症反应产生积极影响（Canlon等人，年;Motohashi等人。，;Meltser等，）。但是，在进一步的研究中，可以评估性别差异。在受害后的前三天内，急性噪声暴露会在中高频区域引起大约40–50dB的瞬态阈值偏移。听力损失在3周内部分恢复，留下大约25–30dB的永久阈值偏移。噪声和噪声车辆组之间未观察到显着差异（数据未显示），表明鼓膜注射程序和媒介物本身对听觉功能均无显着影响。此外，在正常听觉动物中进行的对照实验表明，吡格列酮或媒介物注射本身并没有显着改变听觉阈值，在经过鼓膜注射后第21天进行监测（补充图）S1）。
我们探讨了立即给予吡格列酮（1h）vs.的疗效。在噪声暴露后的延迟时间点（24和48小时）。如图1所示，在接受吡格列酮治疗的耳朵中，噪声暴露后1小时处理的动物在中高频处的阈值漂移明显降低了约20–30dB，而对侧车辆中观察到的阈值漂移约为40–50dB处理过的耳朵（图1A，B）。吡格列酮治疗后第1天，阈值变化明显降低，并且在整个3周的随访期间的所有时间点均持续存在（图1A，B，G）。值得注意的是，到治疗后第21天，吡格列酮治疗的耳朵在中高频时已恢复到基线的10dB以内，而媒介物处理的耳朵表现出约20–30dB的残余听力损失（图1G）。
图1
图1.吡格列酮可防止噪音引起的听力损失。（A–F）图显示了测量的中频（12–16kHz，A，C，E）和高频（20–24–32kHz，B，D，F）的平均阈值偏移值（平均值±SEM）1，3，7，14和21天车辆（黑色正方形;?=24）或匹格列酮注射（灰色钻石;?=24）在动物暴露于噪音和处理1个小时（A，B），24小时（C，D）或在听觉创伤后48h（E，F）。（G–I）图显示了在暴露于噪音并在不同时间点用吡格列酮或媒介物处理的动物在第21天分析的所有频率下的所有阈值（平均值±SEM）。基线值是指在每种情况下吡格列酮或媒介物注射之前估计的听觉阈值。声音创伤后1小时施用的吡格列酮提供了主要的保护作用，中频使阈值漂移降低约15dB，高频使阈值漂移降低约20dB。值得注意的是，低频（6kHz）受声学创伤的影响较小，这与我们的噪音暴露协议（纯音中心为10kHz）一致。延迟给药（在噪声暴露后24和48小时）显示出明显的保护作用，但保护作用稍差（约10-15dB）。AF：星号表示各组之间存在显着差异（?p0.05；span=""??p0.01;???p0.）。span=""（G–I）星号表示“噪声+Pio”和“噪声+车辆”组之间的显着差异（?p0.05；span=""??p0.01；span=""???p0.）。span=""
先前的研究表明，为了成功地靶向早期病理机制，在噪声之前或之后不久进行早期药物干预是至关重要的。因此，评估延迟治疗很有意义。吡格列酮在暴露于噪音后24小时给药后，可以降低治疗组与对照组的阈值漂移。在整个高频中，控制耳朵比在整个随访期间持续的高频（图1C，D）要好大约10–15dB。如图1H所示，在治疗结束时，约15dB的保护作用持续存在。吡格列酮治疗在48h时，阈值偏移降低了10–15dB，这在噪声暴露后3周的最后一个时间点是明显的（图1E，F，I）。
此外，我们检查了噪音暴露和治疗后3周制备的Corti器官基底膜表面制剂中的OHC活力。图2显示了在听觉创伤后的1、24和48小时内，Ctrl，Noise，Noveh-vehicle和Noise-Pio组的Rh-Ph染色和OHC计数。噪声暴露引起的OHCs丢失主要是黑点，指骨疤痕以及表皮板和发束（箭头）的消失（主要限于中基底耳蜗转弯）而引起的（图2B）。与Ctrl组相比，仅在噪声暴露的情况下，在中间转弯时，OHC计数减少到剩余细胞的约60％（图2B，G–I）。噪声车辆组表现出相似的毛细胞损失，与噪声组相比无显着差异（图2C，G-1）。吡格列酮，给药1个小时声损伤后，显著在中间转，其中，细胞计数为约85-90％减少了OHC损失VS。噪声组（图2D，G）。吡格列酮，给药24或声创伤后48小时，促进了OHC存活达到大约75和85％的VS。对照在中部基底转弯处（图2E，F，H，I），与治疗后1小时（图2G）相比，效果稍差。在心尖转弯中各组之间未观察到显着差异（图2G–I），相应于电生理数据。吡格列酮促进OHC存活的作用支持了听力功能的改善。由活性OHC产生的畸变产物耳声发射（DPOAE）的注册可进一步提供吡格列酮对感觉上皮的有效作用，感觉上皮是声波损伤的主要目标（Fetoni等，）。总之，这些结果表明，吡格列酮早期干预可能会抵消早期的氧化应激反应，因此对预防NIHL最有效。但是，观察到延迟治疗也有效，尽管程度较轻，这表明吡格列酮可能靶向其他机制。
图2
图2.形态评估和毛细胞计数。（A–F）Corti器官表面准备的代表性图像，显示了中基底人工耳蜗中F-肌动蛋白的分布。（A）中示出了三排外毛细胞（OHC）和一排内毛细胞（IHC）的典型分布。噪音（B）引起OHC损失（黑点，用箭头指示）。吡格列酮可明显降低噪音车辆状况（C）引起的OHC死亡（DF），特别是在噪音损害（D）后1小时给药。比例尺：20μm。（G–I）耳蜗图（平均值±SEM）显示三种不同给药方案中OHC存活率的百分比。噪声分别在中转和基底转弯分别引起约40％和20％的细胞死亡。吡格列酮的给药可使细胞死亡减少约20–25％。星号表示组之间的差异显著（*p0.05;span=""**p0.01;span=""***p0.;?=6只动物/组）。
吡格列酮减少了噪声暴露引起的耳蜗氧化应激
为了评估吡格列酮对噪声诱导的氧化应激的保护作用，我们在耳蜗切片上进行了免疫荧光分析，以检测超氧阴离子自由基（DHE染色）和脂质过氧化产物8-异前列腺素。
图3说明了通过DHE荧光检测的耳蜗冷冻切片中的超氧化物水平。未暴露于噪音的动物的对照耳蜗中红色荧光微弱（图3A）。对照动物（图3B）和经噪声媒介物处理的动物（图3C）的噪声暴露均使耳蜗超氧化物水平显着增加，这由DHE染色增加所反映，尤其是在SGN，Corti器官和纹状体中检测到血管瘤，也通过荧光强度定量得到证实（图3G）。在噪声车辆1、24和48小时后组之间未观察到显着差异（数据未显示）。在所有耳蜗结构的听觉损伤后1h处理的耳朵中，吡格列酮显着抑制了噪声暴露引起的增加的氧化应激（图3D，G）。吡格列酮延迟给药至噪声后24或48h只能使DHE信号稍微降低（图3E，F）。根据光密度分析，仅在噪声暴露后不久（1h）处理的动物样品中，在所有耳蜗结构中均观察到超氧化物表达的显着差异。即使DHE表达在血管纹中稍明显，延迟治疗也不会导致所有结构的显着差异。（图3G）。
图3
图3.早期吡格列酮给药可减少耳蜗中的超氧化物量。（A–F）DHE（红色荧光）染色的耳蜗冷冻切片（中基底转弯）的代表性图像。（C，D）中显示了Corti器官的插图。超氧化物荧光在对照耳蜗（A）的细胞质中微弱。噪声暴露增加了超氧化物的含量，主要是在螺旋神经节神经元，Corti器官和血管纹中（B）。在噪声和噪声车辆条件（B，C）之间未发现超氧化物量的差异。在噪声暴露后1小时给药时，吡格列酮显着降低主要耳蜗结构中的超氧化物表达（D）。噪声后24小时（E）和48小时（F）施用也可减少超氧化物，但与早期施用相比，其减少程度较小。比例尺：μm。（G）与Noise-Pio和Noise+媒介物组有关的直方图（均值SEM）显示量化了主要耳蜗结构中的荧光强度（AU，任意单位）：螺旋神经节神经元（SGNs），Corti器官（oC）和血管纹（StV）。星号表示各组之间的显着差异（*p0.05；span=""n=每个实验组从6只动物中随机选择的12个切片）。
为了确定脂质过氧化的水平，我们在耳蜗切片中进行了8-Isoprostane免疫荧光。图4表明，与DHE的结果相似，噪声暴露诱导了8-异前列腺素的产生，表明由于噪声创伤导致明显的脂质过氧化损伤（图4B与图4A）。在SGN，Corti器官和血管纹中最明显地增加了8-异前列腺素的含量，相同的结构也表现出最大的超氧化物增加。正如DHE染色报道的那样，噪声车辆在1、24和48小时后组之间没有观察到显着差异（数据未显示）。值得注意的是，吡格列酮给药噪音暴露后1个小时，完全阻断在8-异前列烷的荧光增加VS。媒介物处理过的耳朵（图4C与图4D），特别是在血管纹中。吡格列酮的延迟治疗（24或48h）也减少了8-异前列腺素，残留信号主要存在于SGN中（图4E，F）。SGN，Corti和血管纹中的荧光信号定量证实吡格列酮对抗噪声引起的脂质过氧化的功效主要在创伤后1小时给药时明显可见（图4G）。
图4
图4.暴露于噪音后1小时服用吡格列酮可减少脂质过氧化。（AF）耳蜗冷冻切片（中基底转弯）的代表性图像用脂质过氧化标记（8-异前列腺素，绿色荧光）染色，并用DAPI（蓝色荧光）染色。（C，D）中显示了Corti器官的高倍放大插图。噪声暴露引起所有耳蜗结构（B）中脂质过氧化的增加，相对于暴露于噪声并用赋形剂处理的动物（C）没有差异。对照耳蜗（A）的细胞质中没有脂质过氧化作用。噪声暴露增加了8-异前列腺素的含量，主要在螺旋神经节神经元，Corti器官，特别是在血管纹中（见B中的箭头）。在噪声和噪声车辆条件（C）之间未发现差异。在噪声暴露后1小时给药时，吡格列酮显着降低8-异前列腺素的表达（D）。噪声后24h（E）和48h（F）给药显示出小的但可检测到的抗脂质过氧化作用。比例尺：μm。（G）直方图（平均值±SEM）显示了荧光强度的定量（AU，任意单位），如图3所示。SGN，螺旋神经节神经元；oC，Corti器官；StV，血管纹。星号表示各组之间的显着差异（*p0.05；span=""*pp0.01；span=""n=每个实验组从6只动物中随机选择的12个切片）。
吡格列酮可减少噪声引起的炎症反应
然后，我们评估了吡格列酮对NF-κB（一种在炎症中诱导基因表达的关键调节剂）和IL-1β（一种与耳蜗损伤有关的促炎性细胞因子）的作用。图5，6显示PNF-κB和在从控制和噪声暴露的动物的耳蜗部分IL-1β免疫荧光法，以及用媒介物或吡格列酮或声创伤后48小时视为噪音暴露的动物。在噪声车辆1、24和48小时后组之间未观察到显着差异（数据未显示）。噪声暴露在对照和媒介物处理的耳朵中的所有耳蜗结构中均会显着诱导NF-κB磷酸化（红色荧光）（图5B，C）。吡格列酮有效地阻断了声损伤后所有治疗间隔中噪声诱导的pNF-κB的增加（图5D-F），这也被主要耳蜗结构的光密度分析所证实（图5G）。对于IL-1β，观察到相似的结果。噪声暴露显着上调IL-1β，在SGN和血管纹中检测到最强烈的信号（图6B，C）。吡格列酮有效地阻断了噪声诱导的IL-1β的升高，在治疗后第7天在SGNs或Corti器官的任何时间均未检测到信号，而在血管纹内仅检测到微弱的信号（图6D–G）。有趣的是，这些结果表明，尽管吡格列酮延迟治疗效果较差VS。早期治疗以减少氧化应激（图7A），即使延迟服用吡格列酮也能够阻断噪声诱导的炎症反应，这可通过pNF-κB的减弱来体现（图7B）。
图5
图5.吡格列酮可降低NF-κB的耳蜗表达。所有实验组的耳蜗冰冻切片（中基回合）中的（AF）pNF-κB（红色荧光）和DAPI染色（蓝色荧光）。（C，D）中显示了Corti器官的高倍放大插图。噪声暴露后，所有耳蜗结构中的NF-κB表达均增加（B），而噪声与噪声载体组之间没有差异（C）。当在噪声后1小时（D）施用以及在噪声后24和48小时（E，F）施用时，吡格列酮的局部递送减弱了NF-κB磷酸化。（G）直方图（平均值±SEM）显示了荧光强度的定量（AU，任意单位），如图3所示。SGN，螺旋神经节神经元；oC，Corti器官；StV，血管纹。星号表示各组之间的显着差异（*p0.05；span=""*pp0.01；span=""n=每个实验组从6只动物中随机选择的12个切片）。
图6
图6.吡格列酮抵消了IL-1β表达的增加。（A–F）DAPI染色的耳蜗冰冻切片（中基底回合）中IL-1β表达（绿色荧光）的代表性图像。显示了Corti器官的高倍放大插图（C，D）。吡格列酮治疗（DF）后，噪声暴露（B）后观察到的IL-1β表达增加明显降低。在噪声和噪声车辆组之间没有发现差异（C）。比例尺：μm。（G）直方图（平均值±SEM）显示了荧光强度的定量（AU，任意单位），如图3所示。SGN，螺旋神经节神经元；oC，Corti器官；StV，血管纹。星号表示各组之间的显着差异（*p0.05；span=""*pp0.01；span=""n=每个实验组从6只动物中随机选择的12个切片）。
图7
图7.吡格列酮靶向耳蜗损伤中的氧化/炎症相互作用。（A，B）图显示了在不同的给药方案下，针对不同的免疫荧光分析（8-异前列腺素和NF-κB），荧光强度的移动/减少（通过比较Noise-vehicle与Noise-Pio条件进行测量）噪声暴露后1、24或48小时）。数据表示为平均值±SEM（AU，任意单位）。（C）暴露于噪音并经吡格列酮（N+P;n=6）或媒介物（N+V;n处理）的对照组和动物中pNF-κB和IL-1β的代表性免疫反应带=6）在给药后7天的不同时间点（噪声暴露后1、24或48小时）。药物治疗7天后，NF-κB和IL1-β均降低。
为了扩展和确认免疫荧光结果，我们在耳蜗裂解物中进行了蛋白质印迹分析。图7C显示了从正常听力对照和用吡格列酮或赋形剂处理的噪声暴露动物中分离的耳蜗的蛋白质样品中的pNF-κB和IL-1β免疫反应带。显示了药物治疗后第7天的不同给药时间表（噪声暴露后1、24或48小时）的数据。与免疫荧光结果相似，吡格列酮抑制了噪声诱导的NF-κB磷酸化和IL-1β的增加（图7C）。与免疫荧光结果一致的蛋白质印迹数据证实，吡格列酮可有效减少噪声创伤后早期或延迟给药后的炎症途径。
讨论区
迄今为止，尽管对预防方法进行了广泛的研究，但尚未专门开发和批准用于治疗与听力损失相关疾病的药物。NIHL体内结果显示在这里该模型表明，吡格列酮（PPARγ激动剂）可能代表一种有效且创新的治疗策略，用于与听力损失相关的疾病，例如感觉神经性听力损失，衰老和耳*性。我们的结果提供了吡格列酮减少噪音诱发的炎症反应和耳蜗氧化应激的证据。具体而言，在噪声暴露后的不同时间点，单次鼓室注射吡格列酮会降低：（i）在所有时间点分析的ABR阈值偏移；（ii）Corti器官中的细胞死亡；（iii）耳蜗超氧化物的产生和脂质过氧化，以及（iv）耳蜗NF-κB和IL-1β的炎症反应。
鼓室吡格列酮可减轻NIHL
耳蜗对急性创伤的许多直接反应（ROS生成，脂质过氧化，HC细胞凋亡）都是快速而短暂的（Henderson等，）。因此，需要能够尽可能快地将药物提供给损伤部位的制剂和方法。人们一直在努力通过装置和缓释药物输送系统（例如使用纳米颗粒或可生物降解的水凝胶）来实现这一目标，这可以增加给定药物在中耳中的停留时间并提供向内耳的快速受控药物输送。热敏凝胶代表了一种有前途的方法。这些聚合物具有在体温下在鼓膜腔内过渡到凝胶的优势，从而延长了药物在中耳中的停留时间（Liu等，）。我们的结果表明，吡格列酮凝胶制剂是安全的，因为在接受吡格列酮或媒介物注射的对照动物中未发现阈值升高或耳蜗细胞*性作用（补充图S1）。在功能和形态学水平上，1.2％吡格列酮凝胶混悬液能够有效保护中高频听力，并限制单次药物注射后受到噪声暴露而损害的基底/中转弯处OHC的损失。声音损伤后1小时给药后，最佳的吡格列酮对NIHL的保护作用达到最佳，这与干扰耳蜗对创伤的早期反应机制产生了干扰（图1）。有趣的是，即使在噪声暴露后24或48h延迟服用吡格列酮也显示出降低但显着的保护听力免受噪声伤害的作用（降低的阈值位移升高约10–15dB，图1A，B）。因此，从临床角度来看，该分子在最常见的患者受到噪音损害后需要治疗的情况下有效。也可以假设吡格列酮对暴露于NIHL危险因素的受试者具有预防作用，但是，应该进行进一步的实验研究。
吡格列酮可减轻炎症和氧化应激
在我们的模型，吡格列酮的局部递送不得不通过减少NF-κB和IL-1β表达耳蜗（图耳蜗中的强效抗炎作用5，6）。该抗炎作用在所有给药时间表上均持续存在，并且可能是对噪声损害后24和48小时延迟用吡格列酮治疗的动物的NIHL的显着保护作用的原因。的确，耳蜗对急性噪声暴露的反应中已经涉及到几种与炎症相关的基因和蛋白质（Yamamoto等，;Gratton等，;Nakamoto等，;Fujioka等，）。以及长期暴露于环境噪声之后Tan等人，）。实际上，在我们的急性噪声暴露模型中，炎症调节因子IL-1β和磷酸化NF-κB的表达增加了。NF-κB在细胞质隔离与抑制性卡巴B（IkB的）家庭（直接互动的主要转录因子海登和戈什，年，年;。Gloire等，）。在应激条件下，IkB被磷酸化，释放出NF-κB二聚体，该二聚体易位进入细胞核并驱动基因表达（Hayden和Ghosh，年，年，年；Luan等，年）。NF-κB控制着广泛的基因转录，这些基因在炎症和免疫力中至关重要（Hayden和Ghosh，年；Vallabhapurapu和Karin，年）。在这项研究中，吡格列酮治疗的动物在所有耳蜗结构中均表现出NF-κB磷酸化的降低和IL-1β的抑制。为了支持耳蜗保护的可能作用，已经提出NF-κB信号传导在吡格列酮的作用中起到保护大鼠免受局灶性脑缺血的作用（Zhang等人，）和在几种啮齿动物神经系统模型中疾病（Nakamura等，;Park等，;Swanson等，）。在这些不同的模型中，吡格列酮显示出神经保护和/或恢复作用，主要与炎症调节有关。值得注意的是，吡格列酮在自身免疫性脑脊髓炎的实验模型（Feinstein等，）和培养的神经元（Zhang等，）中上调了脑中IκB的表达。
除对炎症的有益作用外，吡格列酮有效降低了氧化应激，反映为ROS和脂质过氧化作用降低。事实上，氧化应激诱导的噪音暴露（图3，4，超氧化物和8-异前列烷生产）用吡格列酮抵消两者时噪声后给予24或48小时时，声创伤后施用1个小时，并且在较小程度上，接触。我们的体内数据与在庆大霉素耳*性模型中体外获得的最新数据一致，在该模型中，吡格列酮通过上调氧化还原途径基因和增强细胞自身的抗氧化防御作用来提供针对ROS升高，脂质过氧化损伤和HC凋亡的保护（Sekulic-Jablanovicetal。，）。在引用的报告中，吡格列酮通过靶向耳蜗结构中表达的PPARγ和PPARα蛋白，使毛细胞免受庆大霉素的氧化*性和细胞凋亡的影响。我们在此提供的数据暗示这些机制在体内也可能相关，并为吡格列酮在治疗听力下降中提供了实现临床上有意义的作用的潜力。尽管需要进一步的实验来探索吡格列酮在耳蜗中激活PPARγ的作用，但我们的数据也可能与以前的报道一致，其中吡格列酮有效增强了大脑中的酶促抗氧化防御能力（Shimazu等人，年;Suge等人，年）），并证明PPARγ能够通过强大的抗炎和抗氧化作用保护细胞免于凋亡（Abdallah，年；Barroso等人，年）。值得注意的是，在分子水平上，PPARγ激活可稳定线粒体，避免氧化损伤并支持神经元存活（Fuenzalida等，）。此外，据报道吡格列酮特异地结合于线粒体膜内的另一靶标上，该蛋白是增加线粒体内膜完整性和ROS稳态所必需的一类蛋白质（mitoNEET）（Paddock等，；Mittler等，年）。线粒体是损伤后耳蜗细胞中产生的ROS的主要来源，因此吡格列酮的强大保护作用不足为奇，并且与大量文献一致（Henderson等，；Lenaz等，；Fetoni）。等人，）。为了探索NIHL模型中耳蜗的抗氧化作用，治疗的时机至关重要。在我们的模型中，吡格列酮减轻氧化不平衡的能力在给药的早期时间窗（噪音暴露后1小时）最有效，这与已知的耳蜗中ROS产生动力学有关（Seidman等，;Ohinata等，;Jaumann等，）。我们以前的报告显示，在噪音创伤后的最初2小时内，可及早发现ROS，并持续升高到7.5h。噪音侵害后约4小时左右，脂质和蛋白质就会发生过氧化（Maulucci等，）。因此，在较早的时间窗内施用吡格列酮对抗氧化剂的挽救作用是最大的，这阻止了ROS的最初形成，当触发时，ROS可以促进持续的细胞损伤。这些数据与已在采用多酚作为治疗NIHL动物模型中得到了类似的结果（一致Fetoni等人，，A）。
总的来说，吡格列酮的保护作用似乎与抗炎和抗氧化机制有关，表明耳蜗中可能存在ROS/NF-κB信号传导串扰/关系。据报道，ROS以多种方式与NF-κB信号传导途径相互作用。已证明NF-κB依赖基因的转录会影响细胞中ROS的水平，进而NF-κB活性的水平也会受到ROS的水平的影响（Gloire等，;Morgan和Liu，;Blaser等，）。有趣的是，在我们的研究中，吡格列酮的抗氧化作用主要在创伤期（给药后1小时）内，当ROS产生开始增加时很明显，而抗炎作用在噪音暴露后持续了较长时间（24）。和48小时给药），当ROS已经下降时（Kurabi等，）。因此，有可能的是，吡格列酮在暴露于噪音后不久可能会负面地调节ROS/NF-κB串扰（见图7A，B，说明脂质过氧化作用和炎症的降低）。稍后（暴露于噪音后24和48小时），当ROS/NF-κB串扰最大且ROS产量下降时，吡格列酮表现出大部分抗炎作用（见图7）。）。已经在几种细胞类型和生物学条件下对NF-κB的氧化还原调节进行了深入研究，尽管现在很清楚NF-κB的激活机制主要依赖于IkB激活，但氧化还原敏感的途径会触发这种激活以及ROS。/NF-κB相互作用据报道取决于细胞类型而有很大差异（Morgan和Liu，年）。
此外，吡格列酮在耳蜗血管结构血管纹中显示出显着的作用，在该处降低了8-异戊烷的荧光信号，特别是在噪声暴露后1小时处理的动物中。鉴于异前列腺素可能会导致耳蜗血流量减少（Seidman等，；Ohinata等，；Jaumann等，），这些数据表明吡格列酮可能会激活与耳蜗氧化还原相关的缺氧反应途径。噪声暴露引起的不平衡（Zhang等，）。需要进一步的工作来探索这个假设。
总之，这些结果表明吡格列酮在耳蜗中具有多种保护机制，有利地影响氧化应激和炎症。但是，即使吡格列嗪酮在几种情况下充当PPARγ的激动剂，也需要进一步的研究来证明它们在预防耳蜗压力状态中的激活作用。预计早期干预将提供最大的保护，防止外源性伤害，而后期对炎症的有利影响可能有助于更大或持续的疗效，也将扩大有效治疗的机会之窗。这些因素对于治疗急性噪声创伤或突然的感音神经性听力损失后的听力损失非常重要，而快速干预至关重要。吡格列酮通过其多种有利的耳蜗保护机制，
作者贡献
FP：数据收集和解释。AF：研究设计，数据收集，数据分析指导和监督，并撰写手稿。RR：数据收集。MW：研究设计。CG：数据质量控制。DT：数据分析的指导和监督，并撰写了手稿。GP：研究设计，数据质量控制和手稿编辑。
资金
这项工作得到了参加研究设计的MW由StrekinAG（瑞士巴塞尔）提供资金的支持，该研究参加了研究设计，并获得了卡托利卡大学（AF和GP）的壁内资助。共焦分析是在加泰罗尼亚大学的“Labcemi”核心设施中进行的。
利益冲突声明
MW是StrekinAG的员工，并获得薪水和股票期权。资助者在数据收集和解释，或提交作品发表的决定中没有作用。这不会改变我们对共享数据和材料的药理学前沿*策的坚持。
其余作者宣称，该研究是在没有任何商业或金融关系的情况下进行的，这些商业或金融关系可以被解释为潜在的利益冲突。
审阅者AB和处理编辑器声明了他们的共同隶属关系。
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