成都先导药物药效评价团队丨
自身免疫性疾病（Autoimmunedisease，AID），指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，通常病程长、顽固且难以根治，对于患者生活质量有较大影响，严重者危及生命。常见的AID包括银屑病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、I型糖尿病等。
经典的AID包括器官特异性与器官非特异性自身抗体二大类，多与自身抗体有关。通常由于各种原因导致机体免疫调节功能的紊乱，免疫系统无法区别自身细胞和组织，或识别自身或非己的免疫耐受机制被破坏而引起。AID的确切发病机制尚不明确，可能与多种因素有关，如免疫耐受的丢失、免疫反应调节异常，或由于遗传因素或病*诱发。
作为医药工业界研发热点，抗AID药物的临床前研发阶段需要借助实验动物模型评价候选化合物的优劣，对于临床阶段的疗效进行预测，并对于药物调控疾病的潜在机理进行阐明。本文对于常见的AID及其较广泛使用的动物疾病模型进行简要介绍。
银屑病及银屑病相关动物模型
银屑病（Psoriasis）,俗称“牛皮癣”，是最为常见的慢性AID，常发于青壮年人群，在世界范围内发病率约1-3%。银屑病发病顽固且持续，最显著特征为皮肤表面红肿及白色鳞屑的覆盖，其病因尚不明确，目前认为是遗传和环境因素共同作用导致，如感染、压力、肥胖、吸烟等因素都可能对于疾病产生诱发作用。目前临床上尚无根治银屑病的特效药物，故治疗银屑病主要以控制症状为主，如外用维生素D3类似物、糖皮质激素和维A酸，系统性使用糖皮质激素、甲氨蝶呤，以及免疫抑制剂如环孢素A、他克莫司等。近年来随生物制药的发展，多种抗体类药物也对于银屑病具有较好疗效。
科学研究中银屑病的实验动物模型主要分为自发形成、基因工程改造、病灶原位移植和直接诱发四类，受限于模型建立难度和成本，直接诱发类模型使用最为广泛，以下介绍两种基于小鼠的银屑病直接诱发模型。
（一）咪喹莫特诱导小鼠银屑病皮损模型
咪喹莫特（Imiquimod，IMQ）是Toll样受体7/8的抑制剂，临床上用来治疗病*感染。使用IMQ乳膏在小鼠背部连续涂抹5~7天，会出现皮肤增厚、红斑、鳞屑等类银屑病样症状。该模型稳定、易建立、操作简单且应用广泛。
a.PASI评分
根据PASI评分标准对小鼠背部皮肤炎症情况评分（包括银屑，红斑，肥厚），记录累积评分、体重与皮肤厚度变化。对照组空白乳膏处理未表现炎症特征，模型组IMQ处理之后，逐渐表现出皮肤炎症特征及厚度增加，第5天PASI评分达到最高值，体重在IMQ处理的第3天下降到最低点，而后逐渐恢复，阳性药抗体可降低PASI评分与皮肤厚度的增加。
图1:模型条件下小鼠背部皮肤PASI评分持续升高，体重下降，皮肤厚度增加；IL17A抗体可显著逆转皮肤病变
b.形态学检查
IMQ连续处理5天后对于小鼠背部皮肤外观形态进行观察，并利用HE染色分析组织病理学变化。图片中可见，小鼠皮肤出现红斑，鳞屑与厚度增加；HE染色结果显示IMQ处理促进了炎性细胞的浸润，表皮细胞的增生；免疫组化结果显示银屑病相关PDmarkerIL-6在皮肤中表达水平增加。对于上述病变，阳性药IL17A抗体具有明显的改善作用。
图2:模型条件下小鼠皮肤产生显著红斑、鳞屑和增厚病变，HE染色结果可见组织增生和炎症细胞浸润，免疫组化结果可见银屑病生物标记物IL-6表达上升。IL17A抗体可以显著抑制上述病理变化
c.Bio-marker检测
IMQ处理5天后收集血浆，通过ELISA检测相关细胞因子的含量，收集皮肤组织通过qRT-PCR检测相关Marker基因的转录水平。结果表明，IMQ处理诱导了IL-6、IL-β与CXCL1等炎性细胞因子产生，阳性药抗体具有较强的抑制作用。
图3：模型条件下血浆、皮肤中相关炎症生物标志物表达水平急剧上升，IL17A抗体可显著抑制其水平
（二）IL-23诱导小鼠耳廓银屑病样变模型
研究证明，IL-23/Th17信号通路在银屑病的发生和发展中起关键作用，IL-23刺激并促进Th17细胞的分化，促进Th17细胞的发展以及细胞因子（如IL-17A，IL-17F和IL-22）的产生，从而产生类似银屑病的病理特征。通过向小鼠耳部皮肤内直接注射IL-23可诱导局部的银屑样病变，该模型是常用的另一个银屑病动物模型，且由于机制清晰，常被用于各类靶向药物的临床前药效评价中。
重组IL-23蛋白于造模的第1、3、5、7日通过皮下给药注射于小鼠耳以建立模型耳廓，其间给予抗炎药物供试品或阳性药物。
小鼠耳朵厚度变化以及病理检测结果显示，模型组小鼠耳厚度明显增加，而阳性药物地塞米松（Dex）产生了显著保护作用。而病理结果显示，给予IL-23造模之后小鼠耳厚增加，表皮增厚且炎细胞浸润明显，地塞米松对于上述病变具有显著改善作用。
图4：耳内注射IL23细胞因子造模可造成耳部产生银屑病样病变，表现为耳厚显著增加，HE染色结果显示造模产生银屑病相关的病理变化。阳性药物地塞米松可以对于病变产生显著抑制
类风湿性关节炎（RA）及动物模型
类风湿性关节炎（rheumatoidarthritis，RA）是一种以关节病变为主的系统性自身免疫性疾病。以慢性、进行性、侵袭性关节部位炎症为主要表现，临床特征为关节红肿疼痛甚至僵直、破骨细胞的形成以及关节骨质受损等，严重可导致关节畸形乃至功能丧失，致残率高。RA多发于中老年女性人群，我国整体发病率约0.3-0.4%。发病机制尚不明确，可能由遗传、感染、环境等因素综合导致。
目前临床治疗RA仍以非甾体抗炎药和抗风湿类药物如甲氨蝶呤、柳氮磺吡啶、羟氯喹等。近年来抗体类药物发展迅速，如TNF-α单抗（Infliximab，Adalimumab）、IL6受体单抗（Tocilizumab）、CD20抗体（Rituximab）等药物对于风湿性关节炎的治疗能够取得较为理想的疗效。
目前类风湿性关节炎的动物模型主要分为佐剂诱导（AIA）和胶原（CIA）诱导两种，其中由于CIA模型通常可在小鼠上成模而使用范围更广。
胶原诱导的类风湿性关节炎（CIA）模型
应用DBA/1小鼠，第0天注射Ⅱ型胶原蛋白与弗氏完全佐剂（CFA），第21天注射Ⅱ型胶原蛋白与非弗氏完全佐剂（IFA），可诱导小鼠关节炎发生，小鼠发病程度、节点较为稳定，严重程度区分度较高，适用于抗自体免疫性疾病药物的评价。
a.临床评分与细胞因子检测
Ⅱ型胶原蛋白免疫2次之后，DBA/1小鼠陆续发病且严重程度随时间升高。每日根据炎症严重程度进行评分可见，模型组病变较严重，而IL17抗体作为阳参试剂可显著控制疾病发生发展，并抑制发病率的持续增加。
图5：注射CII胶原造模后28-42天内，关节炎评分和发病率持续增加，血浆炎症因子IL6水平激增；给予IL17A抗体后，发病和炎症因子水平皆受到抑制。
实验终点收集小鼠血浆通过ELISA检测PDMarkerIL-6的血浆浓度，可见模型组IL-6含量显著升高，抗体可抑制IL-6升高的趋势。
图6：注射CII胶原造模后28-42天内，关节炎评分和发病率持续增加，血浆炎症因子IL6水平激增；给予IL17A抗体后，发病和炎症因子水平皆受到抑制。
b.Micro-CT和病理学检查
实验终点对小鼠脚趾、踝关节进行Micro-CT检查和病理学分析。Micro-CT检查显示，模型组小鼠关节骨质受到严重损伤，而抗体产生了显著保护作用。
图7：Micro-CT结果显示，关节炎造模使小鼠骨关节受到显著破坏，产生骨质损伤；IL17A抗体可显著逆转骨关节损伤
HE染色结果显示，CIA造模造成了小鼠踝关节的严重损伤和大量炎症细胞浸润，而IL17A抗体给药逆转了损伤和炎症反应；使用甲苯胺蓝染色分析踝关节软骨情况显示，模型组小鼠踝关节软骨部分缺失且密度不均，而抗体组小鼠软骨未见显著损伤。
图8：HE染色结果显示造模关节炎小鼠关节腔病变、异常增生严重，炎症细胞大量浸润；甲苯胺蓝染色结果显示小鼠关节软骨受到明显损伤；IL17A抗体可以显著的逆转上述关节炎相关的病理变化
多发性硬化（MS）及动物模型
多发性硬化（multiplesclerosis,MS）是一种以中枢系统炎性反应脱髓鞘疾病为其主要病理特征的罕见中枢神经类自身免疫性疾病，多发于20-40岁中年人群，女性患者较多，国内每十万人发病率约为0.。多发性硬化存在反复发病的特点，难以治愈，临床表现为肢体无力导致的偏瘫、截瘫或四肢瘫痪，感觉异常，眼部异常，共济运动障碍等，严重影响患者生存质量并威胁生命。目前临床尚无特效药物，常以皮质类固醇为主要治疗手段，辅以血浆置换等方式进行。
科学研究中，常以实验性自身免疫性脑脊髓炎模型（ExperimentalAutoimmuneEncephalomyelitis，EAE）进行多发性硬化机理及相关药物研发的研究。
实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)模型
在C57BL/6小鼠上，使用弗氏完全佐剂（CFA）乳化抗原肽MOG35-55，通过皮下注射诱导小鼠发生免疫反应，在注射MOG后2小时与48小时两次腹腔注射百日咳*素（PTX）增加血脑屏障通透性，即可构建EAE模型。
a.临床评分
通常免疫后9天小鼠出现尾部无力，后肢瘫痪，共济失调等中枢神经系统损伤引起的症状，于17-21天临床评分达到最大值。阳性药IL17A抗体可明显抑制发病症状，降低临床评分，改善小鼠发病造成的体重下降。
图9：在使用MOG免疫小鼠之后，小鼠在9-21天内脑脊髓炎评分显著上升；随疾病进展体重也出现明显下降；IL17A抗体给药可逆转脑脊髓炎的发展
b.组织病理学检查
实验终点收集脑与脊髓用于HE染色。结果显示，模型组脑组织有大量炎性细胞浸润，皮质区胶质细胞增生，海马区锥体细胞空泡变性；脊髓组织小胶质细胞增生，神经纤维脱髓鞘；而阳性药抗体可改善脑与脊髓的脱髓鞘与炎性细胞浸润。
图10：HE染色结果显示，造模小鼠的脊髓和脑组织中大量炎性细胞浸润，结构遭到破坏；IL17A抗体则可逆转上述病理变化
总结
自身免疫性疾病为危害人类健康的一大类疾病，虽多数不具有直接致命性，但会对患者的生存质量产生严重的影响。科学研究和药物研发有赖于可靠的动物疾病模型模拟症状、探索机理以至于评价潜在药物的疗效。
成都先导药物开发股份有限公司（“成都先导”）内部管线致力于肿瘤、炎症/免疫等疾病领域的新药研发。依据内部研发需求，上述疾病模型都已成功建立并有力支持了内部项目IL-17A及JAK家族等免疫相关靶点的抑制剂药效评价，并伴随开展了作用机制和PD/PK相关研究工作，数个项目已经进入先导化合物优化阶段，有望不久将来获得临床候选化合物。
除支撑公司内部管线外，这些模型筛选与药效评价也可通过各种合作形式，为外部伙伴提供药效评价服务。除上述疾病和模型外，常见的自身免疫疾病模型如模拟炎症性肠病（IBD）的DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型，模拟支气管哮喘等疾病的小鼠/大鼠OVA哮喘模型等均在持续建立中，敬请
